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Accompagné de ses frères capucins, Padre Pio œuvrait jusqu'à dix-neuf heures par jour au sein de son église. Cette vidéo datant des années 1950 témoigne de ses longues journées de travail. Au total, on estime à 20 millions le nombre de fidèles ayant assisté à ses messes, et à 5 millions ceux qui se sont confessés à lui. Padre Pio invitait d’ailleurs sans cesse à la confiance : « Courons avec confiance vers le sacrement de pénitence, où le Seigneur nous attend à tout moment avec une tendresse infinie. Et une fois nos péchés pardonnés, oublions-les, car le Seigneur l'a déjà fait avant nous ».
L'Eucharistie était aussi le pivot et le centre de toute sa vie. Il la célèbrait dès 5 heures du matin. « Le monde entier peut vivre sans soleil, mais non sans l'Eucharistie », disait-il. Le 22 septembre 1968, la veille de son retour à Dieu, il a célébré une messe solennelle à l’occasion du cinquantenaire de ses stigmates. « Cinquante ans de vie religieuse, cinquante ans cloué à la croix, cinquante ans de feu dévorant pour toi, Seigneur, pour les êtres que tu as rachetés », confiait-il alors. Le soir même, il a reçu l'extrême onction et s'est éteint quelques heures plus tard, à 2 h 30 le matin du 23 septembre 1968.